引言

拉曼光譜技術(shù)作為一種快速、非破壞性的分析方法，正在成為制藥領(lǐng)域中最&受歡迎的分析測(cè)量工具之一，在原料驗(yàn)證、藥物生產(chǎn)過(guò)程監(jiān)控以及產(chǎn)品質(zhì)量控制中都發(fā)揮了重要作用。拉曼光譜技術(shù)基于拉曼散射原理，通過(guò)測(cè)量樣品與激光光束相互作用后發(fā)生的光子能量變化，獲取樣品的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)信息。在實(shí)際運(yùn)用中，激光首先聚焦到樣品表面，激發(fā)出的非彈性散射信號(hào)（即拉曼信號(hào)）被收集并導(dǎo)入到光譜儀中，光譜儀對(duì)該信號(hào)進(jìn)行波長(zhǎng)分離，再由探測(cè)器將光子能量轉(zhuǎn)換為電信號(hào)以供分析。拉曼光譜技術(shù)的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需提取或制備樣品，并且激光可以輕松地聚焦到樣品來(lái)進(jìn)行化學(xué)測(cè)量，這通常可以在一分鐘或更短的時(shí)間內(nèi)完成。其快速、高靈敏度和高分辨率的優(yōu)勢(shì)使其成為了藥物研發(fā)和生產(chǎn)中的一項(xiàng)重要工具。本文將深入探討拉曼光譜在制藥領(lǐng)域中的具體應(yīng)用，包括藥物結(jié)構(gòu)表征、藥物形態(tài)分析、藥物質(zhì)量控制以及藥物相互作用研究，并結(jié)合真實(shí)案例進(jìn)行詳細(xì)分析。

1. 藥物合成研究

一旦確定了潛在的新藥，就可以開(kāi)發(fā)、優(yōu)化該分子的合成方法。拉曼光譜非常適合監(jiān)測(cè)反應(yīng)物、中間體和產(chǎn)物濃度，確定各種反應(yīng)類(lèi)型（例如Diels-Alder反應(yīng)、Fischer酯化反應(yīng)、格氏反應(yīng)和酰基化反應(yīng)等）的路徑、動(dòng)力學(xué)、機(jī)制、終點(diǎn)和產(chǎn)率。阿司匹林的合成是一個(gè)經(jīng)典的酰基化反應(yīng)，反應(yīng)的歷程一般認(rèn)為有四面體結(jié)構(gòu)的中間體出現(xiàn)，但由于其純凈物難以分離獲取，所以一直沒(méi)有直接的證據(jù)證明該中間體的存在。利用拉曼光譜技術(shù)在反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤檢測(cè)，可以得到在反應(yīng)過(guò)程中不同時(shí)刻的拉曼光譜（圖1 A），發(fā)現(xiàn)了阿司匹林的合成反應(yīng)過(guò)程中有中間體出現(xiàn)，并直接觀(guān)測(cè)到此中間體在波數(shù)為1694cm^-1的位置有一明顯的拉曼特征峰。光譜經(jīng)數(shù)據(jù)處理后，還可以獲得到各組分含量的相對(duì)變化曲線(xiàn)（圖1 B）。

圖1 （A）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的拉曼光譜隨時(shí)間的變化；（B）阿司匹林合成過(guò)程中各組分的回歸系數(shù)及1694cm^-1位置的相對(duì)峰高隨時(shí)間的變化。

通過(guò)在線(xiàn)拉曼光譜可以清楚、直接地看到反應(yīng)的進(jìn)程，輕松確定反應(yīng)速率、速率常數(shù)和產(chǎn)量；在優(yōu)化反應(yīng)器溫度、催化劑濃度和類(lèi)型的影響的同時(shí)，還可用于確定活化能和反應(yīng)終點(diǎn)以及優(yōu)化產(chǎn)率。

2. 藥物晶型研究

大多數(shù)情況下，原研藥企業(yè)會(huì)使用API最&穩(wěn)定的晶型以避免在生產(chǎn)儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生晶型轉(zhuǎn)變。為保險(xiǎn)起見(jiàn)，仿制藥企業(yè)通常會(huì)選擇與參比制劑（RLD）或原研制劑相同的API晶型，以保證相似的穩(wěn)定性和溶出特性。因此，確定原研制劑中API晶型是仿制藥研發(fā)的關(guān)鍵步驟，這也是逆向工程中最重要的任務(wù)。晶型檢測(cè)有著一系列可選擇的分析方法，如X射線(xiàn)粉末衍射、差示掃描量熱、熱重分析、紅外光譜及拉曼光譜等。然而，對(duì)于制劑中無(wú)定形或低含量API的晶型檢測(cè)，可用的方法就相對(duì)較為局限。

2.1制劑中無(wú)定形API的檢測(cè)

X射線(xiàn)粉末衍射被認(rèn)為是多晶型化學(xué)物質(zhì)指紋性和專(zhuān)屬性的首&選表征手段。一般制劑中的API晶型檢測(cè)相對(duì)直接，但當(dāng)API為無(wú)定形時(shí)，X射線(xiàn)粉末衍射檢測(cè)失去作用，如下所述案例。已知某制劑中API有2種固態(tài)形式:無(wú)定形和半水合物。為確定2個(gè)不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的片劑（藥片A、B）中API晶型是否一致，首先需要應(yīng)用X射線(xiàn)粉末衍射對(duì)藥片A、B中API晶型進(jìn)行鑒定。對(duì)比藥片A、B與API的X射線(xiàn)粉末衍射圖可見(jiàn)，藥片A的X射線(xiàn)粉末衍射圖譜與API半水合物特征峰在整個(gè)圖譜上都有很高的吻合度（見(jiàn)圖2a和2d）。因?yàn)樵揂PI只能以無(wú)定形和半水合物形式存在，因此可以基本肯定藥片A所含API為半水合物。當(dāng)比較藥片B的X射線(xiàn)粉末衍射圖譜（見(jiàn)圖2b）與API半水合物時(shí)，很難判斷藥片B中的API是否也為半水合物。由于藥片中同時(shí)含有晶體輔料（如乳糖）和其他無(wú)定形輔料，藥片B中API的晶型無(wú)法通過(guò)X射線(xiàn)粉末衍射來(lái)確定。

圖2 藥片A、藥片B、無(wú)定形API和API半水合物的X射線(xiàn)粉末衍射圖

應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)，比對(duì)圖3中藥片A、B與API的拉曼光譜圖。藥片A的拉曼圖譜與API半水合物的圖譜基本一致（見(jiàn)圖3a和3d）。同時(shí)，藥片B的拉曼圖譜與無(wú)定形API的圖譜基本一致（見(jiàn)圖3b和3c）。因此，在這種情況下，拉曼光譜可以很好地解決無(wú)定形API在制劑中的鑒定問(wèn)題。通常，不同固態(tài)形式API的拉曼光譜間有一定差異。與結(jié)晶形API相比，無(wú)定形API的拉曼光譜表現(xiàn)為更寬的峰形，且有波數(shù)偏移。通過(guò)將實(shí)測(cè)樣品的拉曼光譜與不同晶型API的參考拉曼光譜進(jìn)行比對(duì)，可鑒定制劑中API的晶型。

圖3 藥片A、藥片B、無(wú)定形API和API半水合物的拉曼光譜圖

值得一提的是，通常輔料拉曼信號(hào)很弱，低于A(yíng)PI信號(hào)，故拉曼技術(shù)用于不同廠(chǎng)家不同輔料的相同制劑時(shí)，可以在某些情況下完&全排除輔料對(duì)API的干擾。該特性極利于制劑中低含量API的晶型檢測(cè)，即使API的含量較低，其在制劑中的信號(hào)仍然有可能被檢測(cè)到，這對(duì)于制劑中API的晶型鑒定尤為重要。

2.2制劑中低含量API的檢測(cè)

某原研片中API含量較低，僅為0.5%。文獻(xiàn)報(bào)道API有A、B、E這3種晶型，且晶型E很難制備。比較原研片與文獻(xiàn)中3種晶型的X射線(xiàn)粉末衍射圖，未找到與3種晶型相對(duì)應(yīng)的衍射峰，再將原研片與片劑中主要輔料一水乳糖的X射線(xiàn)粉末衍射圖比較，發(fā)現(xiàn)其X射線(xiàn)粉末衍射圖與一水乳糖幾乎一致（見(jiàn)圖4），表明輔料一水乳糖嚴(yán)重干擾了制劑中API的衍射信號(hào)。

圖4 原研片與一水乳糖以及文獻(xiàn)中API晶型A、B、E的X射線(xiàn)衍射圖

應(yīng)用拉曼技術(shù)采集原研制劑的單點(diǎn)拉曼光譜，因單次采集樣品信號(hào)面積小，可相對(duì)有效避開(kāi)大量輔料的影響，采集到較強(qiáng)的API信號(hào)。將已采集到的原研制劑中的拉曼圖譜與不同晶型的拉曼圖譜相比較，即可鑒定制劑中的API晶型。如圖5所示，該原研片采集到的單點(diǎn)拉曼光譜為較純的API光譜，不受一水乳糖的干擾，且晶型A、B有不同的拉曼特征峰，比對(duì)原研片與晶型A、B的拉曼光譜（見(jiàn)圖6），可明顯看出，原研片中的API為晶型A。

圖5 原研片和一水乳糖的拉曼光譜

圖6 原研片與文獻(xiàn)中API晶型A和B的拉曼光譜

3. 藥物質(zhì)量研究

凍干制劑中藥物分布均勻性在一定程度上可反映制劑微觀(guān)結(jié)構(gòu)的一致性，與凍干工藝密切相關(guān)。預(yù)凍方式、預(yù)凍時(shí)間、凍干曲線(xiàn)都可能影響到藥物和輔料的析出速度與程度，從而影響凍干物結(jié)構(gòu)和藥物分布均勻性。良好的凍干結(jié)構(gòu)能夠保證凍干過(guò)程中溶劑順利逸出，反之會(huì)增加溶劑揮發(fā)阻力。結(jié)構(gòu)上的不均勻可能會(huì)導(dǎo)致局部溶劑殘留增加，甚至可能會(huì)使活性藥物成分局部降解，影響產(chǎn)品穩(wěn)定性和體內(nèi)藥效以及毒性。因此藥物分布均勻性是凍干制劑的一個(gè)重要質(zhì)量屬性，可在多方面影響產(chǎn)品質(zhì)量和體內(nèi)性質(zhì)，有必要對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。

近年來(lái)，基于不同光譜的顯微成像技術(shù)在藥物質(zhì)量表征和研究中得到越來(lái)越多的應(yīng)用，通過(guò)化學(xué)顯微成像可以在保持樣品完整的前提下直觀(guān)獲得樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息。其中，采用拉曼光譜成像法評(píng)價(jià)藥物活性成分在制劑中的分布均勻性受到了較多關(guān)注，主要因?yàn)槠淇梢栽谝欢ǔ潭壬戏从钞a(chǎn)品制劑工藝特征，有助于產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)、工藝分析優(yōu)化以及偽藥劣藥鑒別。該評(píng)價(jià)方法在片劑中的應(yīng)用已相對(duì)成熟，采用夾峰法進(jìn)行成像處理，便可得到各成分在制劑中的分布成像圖。在評(píng)價(jià)注射用凍干制劑中藥物分布均勻性時(shí)，夾峰法進(jìn)行成像處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使將圖譜采集精度減小到步長(zhǎng)1μm，也無(wú)法將制劑中的藥物和輔料區(qū)分，這是因注射用凍干制劑生產(chǎn)工藝與片劑不同導(dǎo)致的。片劑生產(chǎn)工藝中藥物和輔料為物理混合，且粉末粒度通常在微米級(jí)別，將圖譜采集步長(zhǎng)減小到藥物輔料粉末粒度以下，采集到的拉曼光譜為單一成分的光譜圖，因此采用夾峰法成像可將藥物和輔料輕易區(qū)分，觀(guān)察到制劑中藥物成分分布的圖像。而凍干制劑通常將藥物和輔料先全部溶解于同一介質(zhì)中，經(jīng)過(guò)冷凍干燥過(guò)程將液體介質(zhì)去除形成固體凍干物。此時(shí)藥物在輔料中呈高度分散的狀態(tài)，大部分掃描點(diǎn)下的光譜圖中都同時(shí)含有藥物和輔料的特征峰，采用夾峰法成像無(wú)法將二者區(qū)分。基于內(nèi)標(biāo)法拉曼光譜定量分析的原理，可采用藥物-輔料峰強(qiáng)度比值法以二者特征峰的相對(duì)強(qiáng)度值對(duì)凍干制劑拉曼圖譜進(jìn)行成像處理。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法可以準(zhǔn)確反映凍干制劑中藥物與輔料的相對(duì)含量，以此對(duì)凍干制劑中藥物分布均勻性進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)。同時(shí)研究中也發(fā)現(xiàn)，由于凍干制劑為疏松多孔的塊狀物，進(jìn)行拉曼光譜采集時(shí)掃描平面不如片劑平整，導(dǎo)致不同掃描點(diǎn)下的拉曼光譜圖信號(hào)強(qiáng)弱不一，而采用峰強(qiáng)度比值法進(jìn)行成像，以藥物輔料相對(duì)含量進(jìn)行評(píng)價(jià)，也可以很好地解決這一缺陷給均勻性分析帶來(lái)的影響。因此峰強(qiáng)度比值法比經(jīng)典的夾峰法更適合用于對(duì)凍干制劑中藥物分布均勻性的評(píng)價(jià)。

圖7 五種產(chǎn)品中培美曲塞二鈉（峰值1625cm^-1）和甘露醇（峰值480 cm^-1）在5個(gè)不同區(qū)域的拉曼強(qiáng)度相對(duì)比值成像圖。標(biāo)尺100μm。

4. 藥物制劑的鑒定

拉曼光譜法是重要的分子光譜技術(shù)，同紅外光譜一樣，可用于化合物結(jié)構(gòu)分析，可以對(duì)原料藥、輔料、藥物晶型、藥物制劑實(shí)現(xiàn)鑒別，其準(zhǔn)確度較高。由于水的拉曼散射效應(yīng)很弱，用拉曼光譜對(duì)水溶性注射劑測(cè)定時(shí)，水不干擾光譜。因此，拉曼光譜在對(duì)注射液品種的鑒別上具有紅外光譜無(wú)法比及的無(wú)前處理、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。

目前已建立了拉曼光譜無(wú)損檢測(cè)液體制劑的快速篩查方法，其原理是通過(guò)從注射液的拉曼光譜中將來(lái)源于水及其他輔料部分有效排除，對(duì)活性藥物成分的拉曼光譜與標(biāo)準(zhǔn)參考光譜進(jìn)行對(duì)比判斷藥物的真?zhèn)蝸?lái)實(shí)現(xiàn)鑒別。

《中國(guó)藥典》2010年版附錄已經(jīng)收載拉曼光譜法指導(dǎo)原則，2015年版藥典通則收錄拉曼光譜法為藥典方法，但還沒(méi)有在品種項(xiàng)下得到體現(xiàn)。在對(duì)2010年版藥典收錄的注射液各論中〔鑒別〕項(xiàng)的調(diào)研中，發(fā)現(xiàn)有氨茶堿注射液、氨甲環(huán)酸注射液等8個(gè)品種采用了紅外光譜法鑒別。由此可見(jiàn)，采用紅外光譜鑒別注射液，主要通過(guò)提取、純化、干燥，在得到純的藥物固體晶體或粉末的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的。前處理的主要目的是消除水及輔料對(duì)紅外光譜圖的影響。拉曼光譜不用提純干燥，可以直接測(cè)試進(jìn)行鑒別。因此可以針對(duì)上述8個(gè)液體品種，探討使用拉曼光譜替代現(xiàn)有的紅外光譜鑒別，或者作為紅外光譜鑒別備選項(xiàng)的科學(xué)性和有效性。

圖8 氨茶堿注射液與氨茶堿對(duì)照品溶液的拉曼光譜圖

圖9 氨甲環(huán)酸注射液與氨甲環(huán)酸對(duì)照品溶液的拉曼光譜圖

由圖8、圖9可知，采用拉曼光譜法進(jìn)行鑒別，具有前處理簡(jiǎn)單，鑒別準(zhǔn)確度與紅外光譜法相當(dāng)?shù)葍?yōu)勢(shì)，因此具有使用拉曼光譜替代現(xiàn)有的紅外鑒別項(xiàng)，或者作為紅外鑒別項(xiàng)的備選項(xiàng)的可能性。通過(guò)對(duì)152個(gè)注射液品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的調(diào)研，發(fā)現(xiàn)有23個(gè)注射液品種〔鑒別〕項(xiàng)下只有一般化學(xué)反應(yīng)，沒(méi)有采用儀器的方法；有143個(gè)品種的〔鑒別〕項(xiàng)下不包含分子光譜的方法。對(duì)于這些品種，拉曼光譜可以作為一個(gè)候選的鑒別方法，作為這些注射液品種鑒別的補(bǔ)充，結(jié)果將是科學(xué)的和有效的。

結(jié)論

綜上所述，拉曼光譜技術(shù)作為一種先進(jìn)的光譜分析方法，在制藥工程中發(fā)揮著重要作用。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，相信拉曼光譜技術(shù)將在制藥工程中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，為藥物研發(fā)和生產(chǎn)提供更加可靠、高效的分析手段，助力制藥行業(yè)不斷取得新的突破和進(jìn)步。

奧譜天成是國(guó)產(chǎn)拉曼光譜儀領(lǐng)&軍&品牌，具有手持式、便攜式、科研級(jí)、工業(yè)在線(xiàn)級(jí)全系列拉曼產(chǎn)品線(xiàn)，能夠?yàn)樗幬镅芯繂挝患肮I(yè)企業(yè)客戶(hù)提供全場(chǎng)景的應(yīng)用解決方案。

奧譜天成生產(chǎn)的拉曼光譜儀產(chǎn)品系列（截止2020年12月）

參考文獻(xiàn)：

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